Listeria: μέθοδοι ανίχνευσης και μικροβιολογικής ανάλυσης
- Γιώργος Κατιρτζόγλου
- Apr 16, 2021
- 6 min read
Updated: May 14, 2021
Η Λιστέρια μονοκυτταρογόνος (Listeria monocytogenes) αποτελεί έναν θετικό κατά Gram,προαιρετικά αερόβιο μη σποριωτικό κοκκοβάκιλλο (Firmicutes), ο οποίος ενδημεί στο έδαφος, στα φυτά και στο νερό. Υπάρχουν 10 είδη του βακτηρίου, ένα από αυτά η Listeria Monocytogenes είναι βλαβερό στους ανθρώπους, αλλά και στα ζώα. Με τη προσβολή του οργανισμού από το συγκεκριμένο είδος προκαλείται η ασθένεια λιστερίαση.
Είναι ένας ανθεκτικός μικροοργανισμός. Σε αντίθεση με τα συνήθη βακτήρια που προκαλούν διάφορες τροφικές δηλητηριάσεις, είναι οξυανεκτικό, αλοανεκτικό και ψυχροανεκτικό καθώς αναπτύσσεται σε θερμοκρασίες +2/+4°C
Η μόλυνση από το συγκεκριμένο βακτήριο μπορεί εξίσου να συμβεί σε κουζίνες εστιατορίων, ακόμα και σε σπιτιών. Γενικότερα, ανιχνεύεται σε περιοχές οπού πραγματοποιείται ο χειρισμός των τροφίμων.
Τα ωμά ψάρια τείνουν να έχουν χαμηλά επίπεδα μόλυνσης .Όμως, μπόρει να συμβεί σε οποιοδήποτε σημείο κατά μήκος της παραγωγής και της επεξεργασίας των τροφίμων. Στη προκείμενη περίπτωση των ψαριών, μπορεί να συμβεί μόλυνση στα μηχανήματα τα οποία χρησιμοποιούνται για αλάτισμα, απολέπιση και τεμαχισμό αυτών.
Η L. monocytogenes μπορεί επίσης να βρεθεί στα κατεψυγμένα και στα καπνιστά ψάρια. Αποτελεί αδύνατο η παραγωγή κρύου-καπνιστού ψαριού το οποίο να είναι σταθερά απαλλαγμένο από το συγκεκριμένο βακτήριο. Αυτό συμβαίνει καθώς κατά το κάπνισμα τους δεν χρησιμοποιείται θέρμανση και για τον λόγο αυτό έχουμε τη χαρακτηριστική λεπτή υφή. Σε αντίθεση με το ζεστό κάπνισμα ψαριού όπου σκοτώνει το βακτήριο ,όμως αφήνει μια λιγότερο σταθερή και υγρή υφή.
Αυτό συμβαίνει καθώς είναι ευαίσθητη στη θέρμανση και στην ακτινοβόληση, με αποτέλεσμα η απολύμανση των νωπών τροφίμων και των συσκευών ή των εργαλείων επεξεργασίας τους να γίνεται εύκολα. Ωστόσο, χωρίς παστερίωση ή επαρκές μαγείρεμα του φαγητού, ο κίνδυνος μόλυνσης δεν μπορεί να εξαλειφθεί πλήρως, λόγω της μεγάλης εξάπλωσης του παθογόνου.
Για την αποφυγή της Listeria βασική οδηγία καθιστά η σωστή απολύμανση , η απόλυτη καθαριότητα στα μηχανήματα και στο χώρο που χρησιμοποιούνται για την επεξεργασία των ψαριών και διαφόρων άλλων τροφίμων. Με απώτερο σκοπό να μη καταφέρει να μολύνει το τρόφιμο.
Η ανίχνευση της Listeria επιτυγχάνεται με διάφορες μεθόδους που εφαρμόζονται όσο στο περιβάλλον, όπου πραγματοποιείται η επεξεργασία τόσο και στο ίδιο το προϊόν. Οι μέθοδοι FDA- BAM Chapter 10 και USDA-FSIS (MLG 8.11) δίνουν την δυνατότητα ανάλυσης περιβαλλοντικών και του προϊόντος δείγματα.
H Listeria στον χώρο.
Η Listeria monocytogenes συνήθως ανιχνεύεται στο εσωτερικό των βιομηχανιών τροφίμων, οπού υπάρχει αρκετό φαγητό και υγρασία. Σε αυτούς τους χώρους υποστηρίζονται οι κατάλληλες συνθήκες όπου επιτρέπουν το βακτήριο να αναπτύσσεται ταχύρρυθμα και σε μεγάλους αριθμούς.
Τα πατώματα και οι αποχετεύσεις που βρίσκονται στους χώρους της βιομηχανίας αποτελούν μέρη ανάπτυξης της Listeria . Χωρίς τη κατάλληλη πρόληψη και απολύμανση του γενικού χώρου, είναι θέμα χρόνου η εξάπλωση της στα μηχανήματα που χρησιμοποιούνται είτε για αλάτισμα είτε για απολέπιση είτε για οτιδήποτε είδους επεξεργασίας των ψαριών.
Για την αποφυγή της ανάπτυξης του βακτηρίου αυτού, είναι απαραίτητο ένα ορθό πλάνο διαχείρισης .Κάθε παραγωγή , πρέπει να σιγουρέψει την αποτροπή εισόδου σε διάφορα παράσιτα , όπως τρωκτικά και έντομα. Η παρουσία γενικού ελέγχου της παραγωγής, όπως η ενδυμασία των εργαζομένων, το συχνό πλύσιμο χεριών και η αποστείρωση των μηχανημάτων, είναι εξίσου απαραίτητη.
Εφαρμόζοντας,λοιπον, αυτό το πλάνο πρέπει να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα του.Μέσω της βοήθειας μαντιλιών και ειδικής διαχείρισης αυτών, δίνεται η δυνατότητα ανίχνευσης του βακτηρίου, δημιουργώντας περιθώρια βελτίωσης για το πλάνο διαχείρισης της Listeria που ήδη πραγματοποιεί η παραγωγή.
Τα εργαλεία που απεικονίζονται αποτελούν βασικό ρόλο δειγματοληψίας για ανίχνευση της Listeria από το χώρο όπου επεξεργάζονται τα ψάρια που είναι προορισμένα να καταψυχθούν. Στην αριστερή εικόνα παρατηρούνται ειδικά μαντηλάκια (στο βαζάκι), μια τσιμπίδα, ένα δοχείο που αποτελείται από 70% αλκοόλ για την αποστείρωση της τσιμπίδας και μια αποστειρωμένη σακούλα όπου θα τοποθετηθεί το δείγμα. Στα δεξιά παρατηρείται μια ειδική μπατονέτα που πραγματοποιεί την δουλειά των παραπάνω εργαλείων όμως με λιγότερη αποτελεσματικότητα. Με τη χρήση αυτών, καθαρίζουμε ένα σημείο ενός μέρους όπου πραγματοποιείται η επεξεργασία και στη συνέχεια τοποθετούμε το δείγμα προσεκτικά μέσα στην αποστειρωμένη σακούλα για να κατευθυνθεί στο εργαστήριο για ανάλυση.
Μέθοδος FDA-BAM Chapter 10
Η μέθοδος FDA-BAM Chapter 10 επισημοποιήθηκε τον Μάρτιο του 2017 και χρησιμεύει στην ανίχνευση της Listeria monocytogenes σε τρόφιμα και στο περιβάλλον επεξεργασίας. Το γενικό μέγεθος του δείγματος ανάλυσης για το τρόφιμο είναι 25 g, το οποίο μπορεί να παρθεί από ατομικές μονάδες ή ως κομμάτι ενός σύνθετου δείγματος. Βασικό μέσο που χρησιμοποιείται κατά τη μέθοδο αυτή είναι ένας ρυθμισμένος ζωμός εμπλουτισμένος με Listeria (Buffered Listeria Enrichment Broth,bLEB).Τα ακόλουθα βήματα διαδικασίας είναι ο εμπλουτισμός, η απομόνωση, επιβεβαίωση και η εξαγωγή αποτελέσματος. Αναλυτικότερα:
Α) Εμπλουτισμός
Στο στάδιο αυτό πραγματοποιείται προσθήκη σε τρυβλίο 25 g του δείγματος και 225 ml του BLEB. Ακολουθεί θέρμανση διάρκειας τεσσάρων ωρών στους 30°C . Στη συνέχεια, γίνεται προσθήκη αντιβιοτικών και διατηρείται η κατάσταση στην ίδια θερμοκρασία για τις επόμενες 24-48 ώρες
Β) Απομόνωση
Μετά τη πάροδο του απαιτούμενου χρόνου, ακολουθεί η επώαση, τοποθετώντας ένα μέρος του δείγματος σε εμπλουτισμένο με Εσκουλίνη άγαρ (πχ. Oxford, PALCAM) για 24 ώρες στους 35°C και ένα μέρος σε χρωμογόνο άγαρ για 24 ώρες στους 37°C.
Γ) Επιβεβαίωση
Από το εμπλουτισμένο με Εσκουλίνη άγαρ διαλέγουμε 5 αποικίες και τις επωάζουμε σε άγαρ TSAYE στη θερμοκρασία των 30°C για διάρκεια 24-48 ωρών. Από το χρωμογόνο άγαρ επιλέγουμε 2 αποικίες τις οποίες εξίσου επωάζουμε στο άγαρ TSAYE, όμως σε θερμοκρασία 35°C για 24-48 ώρες
Δ) Εξαγωγή αποτελέσματος
Η εξαγωγή αποτελέσματος μπορεί να πραγματοποιηθεί με την χρήση του τεστ CAMP (από τα αρχικά Christie-Atkins-Munch-Peterson). Αποτελεί ένα μοτίβο εμβολιασμού του άγαρ, το οποιο δημιουργήθηκε από αίμα προβάτου.Οι οριζόντιες γραμμές παρουσιάζουν διαδοχικούς εμβολιασμούς πέντε ποσοτήτων του δείγματος. Οι κάθετες γραμμές αναπαριστούν διαδοχικούς εμβολιασμούς των Staphylococcus aureus (S) και Rhodococcus equi (R) . Οι διαγώνιες γραμμές (σκιαγραφήσεις) αναπαριστούν τις τοποθεσίες ενισχυμένης αιμόλυσης,όπου και παρατηρείται η Listeria monocytogenes.
Μέθοδος USDA – FSIS (MLG 8.11)
Η μέθοδος USDA-FSIS (MLG 8.11) επισημοποιήθηκε τον Φεβρουάριο του 2019 και αποσκοπεί στην απομόνωση της Listeria monocytogenes και στην ταυτοποίηση της.Βασικό μέσο που χρησιμοποιείται στη συγκεκριμένη μέθοδο είναι ο επιλεκτικός με Listeria ζωμός UVM (UVM Listeria selective broth) ο οποίος αποτελείται από Εσκουλίνη ( Esculin ). Η υδρόλυση αυτής καταλήγει στο μαύρισμα του διαλύματος , όταν κατά τη διάρκεια υπάρχει παρουσία θετικών κατά Εσκουλίνη οργανισμών, όπως αυτός της Listeria monocytogenes.Τα ακόλουθα στάδια διαδικασίας είναι ο προ-εμπλουτισμός, ο επιλεκτικός εμπλουτισμός, η απομόνωση, η επιβεβαίωση και η εξαγωγή αποτελέσματος. Αναλυτικότερα : Α) Προ-εμπλουτισμός Πραγματοποιείται προσθήκη 25 g δείγματος από το ψάρι και από τα ειδικά μαντήλια ,που χρησιμοποιήθηκαν στο χώρο επεξεργασίας , στον επιλεκτικό με Listeria ζωμό UVM για 20-25 ώρες στους 30°C. Τα μεγαλύτερα δείγματα (πχ 125 g) πρέπει να μείνουν στον ζωμό για 23-26 ώρες στην ίδια θερμοκρασία των 30°C. Β) Επιλεκτικός εμπλουτισμός Από το παραπάνω μίγμα που έχει δημιουργηθεί στον UVM ζωμό, λαμβάνουμε 0,1 mL και το τοποθετούμε σε ζωμό MOPS-bLEB για 18-24 ώρες στην θερμοκρασία των 35°C Γ) Απομόνωση Απευθείας, έπειτα από τη πάροδο του απαιτούμενου χρόνου, ακολουθεί επώαση των δειγμάτων που βρίσκονται και στον UVM ζωμό και αυτών που βρίσκονται στον MOPS-bLEB σε τροποποιημένο άγαρ Oxford (MOX agar).Η επώαση αυτή θα διαρκέσει 24-28 ώρες στη θερμοκρασία των 35°C
Δ) Επιβεβαίωση
Στα πλαίσια της επιβεβαίωσης πρέπει να μεταφερθούν αποικίες από το τροποποιημένο άγαρ Oxford σε άγαρ το οποίο επικαλύπτεται από αίμα αλόγου για 18-25 ώρες στους 35°C.
Ε) Εξαγωγή αποτελέσματος
Η εξαγωγή του αποτελέσματος μπορεί να πραγματοποιηθεί μέσω της εξέτασης της β-αιμόλυσης ,αλλά και μέσω του χρώματος του ζωμού. Όπως αναφέρθηκε, ο ζωμός UVM περιέχει Εσκουλίνη η οποία είναι υπεύθυνη για το μαύρο χρώμα που θα υπάρξει σε περίπτωση που υδρολυθεί με άλλον θετικό κατά εσκουλίνη οργανισμό, όπως η Listeria monocytogenes.Το χαρακτηριστικό μαύρο χρώμα εξαρτάται από τον αριθμό των μορίων Listeria που εμφανίζονται στο δείγμα. Όσο περισσότερα μόρια βρίσκονται στο δείγμα τόσο πιο μαύρος γίνεται ο ζωμός. Ωστόσο, το μαύρισμα δεν είναι πάντα αποδοτικό και δεν αποφέρει αποτελέσματα, καθώς 10.000 μονάδες καλλιεργημένων αποικιών ανά mL δεν προσδίδουν το μαύρο χρώμα στο ζωμό.
Βιβλιογραφία
BfR Federal Institute for Risk Assessment (2020).”Invisible threat:Listeria in smoked fish.”Science Daily[Οnline].[ημερομηνία πρόσβασης 3 Δεκεμβρίου].Διαθέσιμο στο: https://www.sciencedaily.com/releases/2020/10/201007123057.htm?fbclid=IwAR1N28jUjaqu32Esb5ClljOVcycj_-1i8halYDK6T1WZ4iGco324leRXFek
United State Department of Agriculture, 2019.”Isolation and Identification of Listeria monocytogenes from Red Meat,Poultry, Ready to Eat Siluriformes(Fish),Egg products and environmental samples”.18 pages.[Online].[ημερομηνία πρόσβασης 6 Δεκεμβρίου ].Διαθέσιμο στο: https://www.fsis.usda.gov/wps/wcm/connect/1710bee8-76b9-4e6c-92fc-fdc290dbfa92/MLG-8.pdf?MOD=AJPERES&fbclid=IwAR1zoMbN86qgASeMtzWbxGVu5wA5sHoVx1QpW_jmSm7iAsFgxHnl7nMOVsc
Merck,2019.”Detection of Listeria monocytogenes in Food and Environmental Samples”.Rapid Microbiology[Online].[ημερομηνία πρόσβασης 6 Δεκεμβρίου].Διαθέσιμο στο:
Anthony D. Hitchins,Karen Jinneman and Yi Chen(2017).”BAM Chapter 10: Detection of Listeria monocytogenes in Foods and Environmental Samples, and Enumeration of Listeria monocytogenes in Foods”U.S Food&Drug Administration[Online].[ημερομηνία πρόσβασης 5 Δεκεμβρίου]Διαθέσιμο στο: https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-10-detection-listeria-monocytogenes-foods-and-environmental-samples-and-enumeration?fbclid=IwAR14DPS4PoqthTkMwOQALfcXw6wKwL5cwXOcTjLJUiOcHQl0nZRZKpZffGo
Ministry for Primary Industries,2020.Listeria/MPI/NZ Goverment.[Οnline].[ημερομηνία 7 Δεκεμβρίου]Διαθέσιμο στο: https://www.mpi.govt.nz/science/food-safety-and-suitability-research/listeria/
Sagar Aryal,2019. “CAMP Test- Principle, Uses, Procedure and Result Interpretation”.Microbiology Info[Online].[ημερομηνία πρόσβασης 6 Δεκεμβρίου]Διαθέσιμο στο: https://microbiologyinfo.com/camp-test-principle-uses-procedure-result-interpretation/
European Food Safety Authority,2020.Listeria infections in humans.[Online].[ημερομηνία πρόσβασης 4 Δεκεμβρίου]Διαθέσιμο στο:
Vincent Ho(2019).”What is listeria and how does it spread in smoked salmon?”Medical Express[Online].[ημερομηνία πρόσβασης 5 Δεκεμβρίου]Διαθέσιμο στο: https://medicalxpress.com/news/2019-07-listeria-salmon.html?fbclid=IwAR2oD4xzDzEjeUX2hq9mdcXzouIHf_E21ifcWT0Fm8T8OJnMDYmGSemNUZE
Davy Verheyen,Araceli Bolivar,Maria Baka et al(2018).” Effect of food microstructure on growth dynamics of Listeria monocytogenes in fish-based model systems”.vol.283.Pages 7-13[Online.] [ημερομηνία πρόσβασης 6 Δεκεμβρίου] Διαθέσιμο στο: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160518303039
News Desk,2020.”German agency warns of Listeria risk in fish”.Food Safety News[Online].[ημερομηνία πρόσβασης 7 Δεκεμβρίου]Διαθέσιμο στο : https://www.foodsafetynews.com/2020/10/german-agency-warns-of-listeria-risk-in-fish/
Brock(2018).”Βιλογία των μικροοργανισμών”.Κεφάλαιο Έκδοση:14η.(σελ 1054-1056).Επιμελητής: Τάσος Οικονόμου.Ηρακλειο: Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης (ΠΕΚ)
D.Greenwood(2016).”Ιατρική μικροβιολογία” . (σελ 245-246).Επιμελητής: Αθανάσιος Τσακρής.Αθήνα:Ιατρικές Εκδόσεις Χ.Πασχαλίδης.
Γιώργος Κατιρτζόγλου
Commenti