Προσδιορισμός των κατεχίνων στα φύλλα του φυτού camellia simensis με τη μέθοδο υψηλής χρωματογραφίας

ΤΟ ΤΣΑΙ ΚΑΙ ΟΙ ΚΑΤΕΧΙΝΕΣ ΤΟΥ

Το τσάι είναι ένα από τα πιο δημοφιλή ροφήματα στον κόσμο, με καταγωγή από την Ασία, το οποίο προέρχεται από τα φύλλα του φυτού Camellia sinensis και παράγεται από την αποξήρανση και το ψήσιμο αυτών. Το τσάι, και συγκεκριμένα το πράσινο τσάι, είναι το μόνο τρόφιμο που θεωρείται ότι περιέχει σημαντικά επίπεδα κατεχινών, ουσιών που διαδραματίζουν τεράστιο ρόλο στην υγεία του ανθρώπου λόγω των ποικίλων θεραπευτικών ιδιοτήτων τους. Οι κατεχίνες έχουν αντιοξειδωτική ικανότητα, καθώς επίσης προσδίδουν στο τσάι συγκεκριμένα χαρακτηριστικά όπως τη πικρή του γεύση. Από χημικής απόψεως, οι κατεχίνες είναι μία ομάδα από ενώσεις πολυφαινολών των οποίων η μοριακή δομή έχει έναν σκελετό που αποτελείται από διφαινιλοπροπάνιο. Οι κατεχίνες που εντοπίζονται στο τσάι είναι οι: κατεχίνη (C), επικατεχίνη (EC), επιγαλλοκατεχίνη (EGC), επικατεχίνη γαλλικού εστέρα (ECG), επιγαλλοκατεχίνη γαλλικού εστέρα (EGCG), γαλλοκατεχίνη (GC) και γαλλοκατεχίνη γαλλικού εστέρα (GCG). Η κύρια κατεχίνη του φυτού αυτού είναι η EGCG και αποτελεί το 50% της ολικής ποσότητας των κατεχινών στο τσάι. Ένα ποτήρι πράσινου τσαγιού υπολογίζεται ότι μπορεί να περιέχει περίπου 100-200 mg EGCG. [Huafu, et al (2003), Qiang, et al (2009), Andreas, et al (2019), Yongjun, et al (2020)]

1.2 ΜΕΘΟΔΟΣ HPLC

Συνήθως, ο προσδιορισμός των κατεχινών στο τσάι γίνεται με την μέθοδο της υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC). Αυτή η τεχνική χρησιμοποιείται κυρίως για τον διαχωρισμό, την ποσοτικοποίηση και την ταυτοποίηση μορίων περίπλοκων μειγμάτων σε χημικά και βιολογικά συστήματα. Περιλαμβάνει δύο φάσεις, μια στατική φάση και μια κινητή, η οποία ρέει διαμέσου της πρώτης με τη βοήθεια αντλίας. Ο διαχωρισμός των ουσιών στηρίζεται στον διαφορετικό βαθμό αλληλεπίδρασης της κάθε μίας με τις δύο φάσεις. Η μέθοδος αυτή επιλέγεται λόγω του ότι είναι ιδιαίτερα ακριβής και εξειδικευμένη. Επιπλέον, στην HPLC κρίσιμο ρόλο διαδραματίζει και η επιλογή του ανιχνευτή που θα χρησιμοποιηθεί διότι μέσω αυτού πρέπει να εξασφαλίζεται η ανίχνευση όλων τον ζητούμενων ουσιών. Οι πιο ευρέως εφαρμοσμένοι ανιχνευτές είναι: ο ανιχνευτής UV, ο οποίος είναι ικανός να ελέγχει αρκετά μήκη κύματος ταυτόχρονα, ο ανιχνευτής συστοιχίας φωτοδιόδων (PDA) και ο ανιχνευτής μεταβλητού μήκους κύματος (VWD) που χρησιμοποιείται όταν πρέπει να γίνει έγχυση ενός μείγματος πολλές φορές, με μεταβαλλόμενο μήκος κύματος, για την επιβεβαίωση της ανίχνευσης όλων των κορυφών ενός κύματος. [Fernandez, et al (2000), Huafu, et al (2003), Qiang, et al (2009), Wakamatsu, et al (2019)]

2. ΑΝΑΛΥΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

2.1 ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ

Αρχικά, για τον προσδιορισμό των κατεχινών στα φύλλα του πράσινου τσαγιού, πρέπει να λάβουμε το εκχύλισμα των φύλλων. Το εκχύλισμα αυτό μπορούμε να το αντλήσουμε είτε από τα φρέσκα φύλλα του φυτού είτε από τα αποξηραμένα φύλλα είτε από το αποξηραμένο απόσταγμα αυτών. Σε αυτό το στάδιο, σημαντικό ρόλο έχει και η δειγματοληψία του τροφίμου. Για να είναι αξιόπιστα τα αποτελέσματα της ανάλυσης, το δείγμα, δηλαδή τα φύλλα του τσαγιού, πρέπει να συλλεχθούν από διάφορα σημεία του χωραφιού κι έπειτα να αναμιχθούν μεταξύ τους. Επιπλέον, για να λάβουμε αξιόπιστα αποτελέσματα θα πρέπει να επαναλάβουμε την μέθοδο 3-5 φορές. Παράλληλα, καλό θα ήταν να συγκρίνουμε και δείγματα τσαγιού από διαφορετικές περιοχές καθώς και διαφορετικά είδη. [ Qiang, et al (2009), Yongjun, et al (2020)]

Στην περίπτωση των φρέσκων ή αποξηραμένων φύλλων, χρησιμοποιούνται περίπου 0,25 g τριμμένων φύλλων τα οποία εκχυλίζονται με 40 ml διαλύματος αιθανόλης/νερού (10:90, v/v) με την μέθοδο υπερήχων για 20 λεπτά. Το εκχύλισμα έπειτα φιλτράρεται και τοποθετείται σε ογκομετρικό δοχείο 50 ml. Επίσης, συμπληρώνουμε με διάλυμα αιθανόλης/νερού το δείγμα μας ώσπου αυτό να γίνει 50 ml. Παράλληλα, ξεπλένουμε το δοχείο και το φίλτρο με το διάλυμα αυτό ώστε να μην μείνουν ίχνη του εκχυλίσματος στα τοιχώματα του δοχείου και στο φίλτρο. Τέλος, περίπου 1 ml από το δείγμα φυγοκεντρείται σε 13000 rpm για 10 λεπτά. Σύμφωνα με μία πιο πρόσφατη έρευνα, το εκχύλισμα του τσαγιού προετοιμάζεται τοποθετώντας φύλλα τσαγιού 10 mg σε έναν μύλο και θρυμματίζοντας τα. Στη συνέχεια, εκχυλίζονται για 10 λεπτά σε 10 ml ζεστού νερού στους 60, 70 και 80οC. Βάζουμε 10 mg του εκχυλίσματος σε κωνική φιάλη, προσθέτουμε 2 ml μείγματος 1:1 ακετονιτριλίου και νερού και το αφήνουμε για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (20-25οC) στο σκοτάδι. Τέλος, προσθέτουμε απιονισμένο νερό μέχρι ο όγκος να γίνει 10 ml. [Qiang, et al (2009), Yongjun, et al (2020), Wakamatsu, et al (2020)]

Στην δεύτερη περίπτωση, πρέπει να προηγηθεί ξήρανση του φρέσκου τσαγιού. Αρχικά, 50 g φύλλων τσαγιού εκχυλίζονται με 500 ml απιονισμένου νερού στους 80οC για 1 ώρα. Το διάλυμα φιλτράρεται και το διήθημα συλλέγεται και συμπυκνώνεται σε 100 ml σε περιστροφικό εξατμιστή. Μετά προστίθεται χλωροφόρμιο (50ml*2) για την απομάκρυνση της καφεΐνης, των λιπιδίων και της χλωροφύλλης. Η υγρή φάση εκχυλίζεται με οξικό αιθυλεστέρα (100ml*2). Στην συνέχεια, γίνεται εξάτμιση του οξικού αιθυλεστέρα στους 40οC υπό συνθήκες μειωμένης πίεσης. Τέλος, το αποξηραμένο διάλυμα φυλάσσεται στην κατάψυξη. Για την παρασκευή εκχυλίσματος από το αποξηραμένο διάλυμα χρησιμοποιούνται 20-50 mg αυτού και το τοποθετούμε σε ογκομετρικό δοχείο 50 ml. Ακολουθεί η διάλυση του σε νερό και η εφαρμογή της μεθόδου υπερήχων για 1 λεπτό. Έπειτα, συμπληρώνουμε νε νερό ώσπου ο όγκος του διαλύματος να γίνει 50 ml. Στη συνέχεια, εφαρμόζουμε στο δείγμα φυγοκέντριση 13000 rpm για 10 λεπτά. Έτσι το εκχύλισμα είναι έτοιμο για χρήση. [Qiang, et al (2009), Yongjun, et al (2020), Wakamatsu, et al (2020)]

2.2 ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΟΥ ΠΡΟΤΥΠΟΥ ΔΙΑΛΥΜΑΤΟΣ ΚΑΤΕΧΙΝΩΝ

Για να γίνει ο κατάλληλος προσδιορισμός των κατεχινών απαιτείται η παραγωγή ενός πρότυπου διαλύματος κατεχινών για την σύγκριση αυτού με το παραπάνω εκχύλισμα.

Αρχικά, ζυγίζουμε περίπου 10 mg από κάθε κατεχίνη, η οποία είναι σε μορφή σκόνης, και τα τοποθετούμε σε ογκομετρικό δοχείο των 25 ml. Έπειτα, προσθέτουμε απιονισμένο νερό και τοποθετούμε το δοχείο σε μηχάνημα υπερήχων για 1 λεπτό ώστε να επιτευχθεί η μέγιστη δυνατή διάλυση των κατεχινών. Όταν έρθει η στιγμή για χρήση αυτού του διαλύματος θα πρέπει να προηγηθεί αραίωση 5/1000. Δηλαδή να γίνουν πέντε διαδοχικές αραιώσεις. [Qiang, et al (2009), Yongjun, et al (2020), Wakamatsu, et al (2020), AlHafez, et al (2014)]

Αφού παρασκευαστεί το πρότυπο διάλυμα θα πρέπει να χρησιμοποιηθεί σε σύντομο χρονικό διάστημα ή να διατηρηθεί σε χαμηλή θερμοκρασία αλλιώς το διάλυμα χάνει την σταθερότητα του δίνοντας μας ψευδή αποτελέσματα. Οι επιθυμητές θερμοκρασίες διατήρησης αυτού είναι 5οC στο ψυγείο ή -10οC στην κατάψυξη. [Qiang, et al (2009), Yongjun, et al (2020), Wakamatsu, et al (2020), AlHafez, et al (2014)]

2.3 ΑΝΑΛΥΣΗ ΚΑΤΕΧΙΝΩΝ ME THN ΜΕΘΟΔΟΣ HPLC

Για την μέθοδο ανίχνευσης των κατεχινών χρησιμοποιείται ένα 1100 σύστημα υγρής χρωματογραφίας με στήλη Hypersil ODS C18 (4.0*150mm). Η στήλη αυτή αποτελεί την στατική φάση. Η ανάλυση λαμβάνει χώρα κάτω από σταθερή θερμοκρασία 25/30οC. Η κινητή φάση περιλαμβάνει ένα ομογενές διάλυμα 0.2% ακετονιτριλίου και μεθανόλης. Ο μέγιστος βαθμός διαχωρισμού των κατεχινών επιτυγχάνεται σε χρονικό διάστημα 25 λεπτών. Έπειτα, η κινητή φάση φιλτράρεται (0.45 μm, Millipore) και μετά υπόκειται εξαέρωση. Στην ανάλυση χρησιμοποιείται στήλη εμβολιασμού του δείγματος 20 μl (μπορεί να χρησιμοποιηθεί και στήλη εμβολιασμού 10 μl). Η ανίχνευση επιτυγχάνεται με τη χρήση ενός ανιχνευτή συστοιχίας ( diode array detector) σε 280 ή 210 nm. Ο ανιχνευτής καταγράφει την απορρόφηση της υπεριώδους ακτινοβολίας που εκπέμπει το δείγμα. Σε αυτό το σημείο είναι σημαντικό να αναφέρουμε ότι η εφαρμογή μήκους κύματος 210 nm βοηθάει στην καλύτερη ανίχνευση της κατεχίνης (C) και της γαλλοκατεχίνης (GC). Τέλος, τα αποτελέσματα του δείγματος συγκρίνονται με αυτά του πρότυπου διαλύματος ελέγχοντας την καθαρότητα των κορυφών. [Fernandez, et al (1999), Qiang, et al (2009), Yongjun, et al (2020), Wakamatsu, et al (2020), Chenxu, et al (2019), Mathivha, et al (2019]

3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

3.1 ΠΕΡΙΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑ ΚΑΤΕΧΙΝΩΝ ΣΤΑ ΦΥΛΛΑ ΤΟΥ ΠΡΑΣΙΝΟΥ ΤΣΑΓΙΟΥ

Η ολική περιεκτικότητα των κατεχινών στο εκχύλισμα είναι γύρω στο 40-50%. Η περιεκτικότητα των κυρίως κατεχινών (EGCG, EGC, ECG, EC) συμπεριλαμβανομένης και της GCG υπολογίστηκε γύρω στο 95-97% της ολικής ποσότητας κατεχινών, ενώ το υπόλοιπο 3-5% είναι οι κατεχίνες CG, GC και C. Στον παρακάτω πίνακα (πίνακας 1.) συγκρίνονται ορισμένα είδη τσαγιού και καταγράφονται αναλυτικά οι ποσότητες κάθε κατεχίνης που ανιχνεύτηκαν στα εκχυλίσματα των δειγμάτων έξι μετρήσεων. Οι πέντε από αυτές τις μετρήσεις έγιναν με αποξηραμένα φύλλα τσαγιού διαφορετικών ειδών ενώ οι δύο με αποξηραμένο εκχύλισμα φύλλων. Η διαδικασία παρασκευής του τσαγιού ακολουθεί κάποια βασικά βήματα. Παρόλα αυτά, κάποια βήματα διαφοροποιούνται ανάλογα με το είδος τσαγιού που επιθυμούμε να παραχθεί και τον τόπο παραγωγής του. Για να γίνουν πιο κατανοητές οι διαφορές μεταξύ των διαφόρων ειδών τσαγιού θα αναφερθούν συνοπτικά οι διαδικασίες παρασκευής τους. Το τσάι Sencha προέρχεται από την Ιαπωνία και παρασκευάζεται με την φυσική αποξήρανση του τσαγιού το οποίο έπειτα ψήνεται σε τηγάνι. Το Ceylon έχει καταγωγή από την Sri Lanka. Τα φύλλα αυτού μαραίνονται και τοποθετούνται σε ειδικού μύλους ώστε να απομακρυνθούν οι χυμοί τους. Ακολουθεί η αλλαγή σχήματος στα φύλλα που επιτυγχάνεται με την συμπίεση αυτών σε ειδικά μηχανήματα και τέλος υπόκειται ψήσιμο σε υψηλές θερμοκρασίες. Το Longjing προέρχεται από την Hangzhou, Zhejiang της Κίνας, και υφίσταται ελαφρώς ψήσιμο σε τηγάνι ακριβώς αφότου συλλεχθεί από τον αγρό. Το τσάι αυτό έχει ένα από τα υψηλότερα επίπεδα σε κατεχίνες. Το Gunpowder κατάγεται από την ανατολική Κίνα και αφού συλλεχθεί και μαραθεί το βάζουν στον ατμό, το επεξεργάζονται με το χέρι δίνοντάς στα φύλλα του σχήμα ελάσματος και τέλος το ξεραίνουν σε ειδικούς φούρνους. Το Assam προέρχεται από την Ινδία και το συναντάμε σε μέρη με υψηλή υγρασία. Αφού μαραθεί και συνθλιβεί σε ειδικούς μύλους ψήνεται σε υψηλές θερμοκρασίες σε φούρνους.

Από την σύγκριση των παραπάνω δειγμάτων καταλήξαμε στα εξής συμπεράσματα. Αρχικά, τα αποξηραμένα εκχυλίσματα περιέχουν μεγαλύτερα ποσοστά κατεχινών από ότι αυτά των αποξηραμένων φύλλων. Το αποξηραμένο εκχύλισμα υπόκειται σε περαιτέρω επεξεργασία με αποτέλεσμα να συνθλίβονται τα κύτταρα του φυτού και να απελευθερώνεται μεγαλύτερη ποσότητα κατεχινών. Επίσης, τα είδη τσαγιών που υπόκεινται θερμική επεξεργασία πολλαπλές φορές, όπως το Ceylon, έχουν χαμηλότερα επίπεδα κατεχινών. Αυτό συμβαίνει λόγω της οξείδωσης η οποία συνεπάγεται τροποποίηση της μορφής των κατεχινών. Ένας ακόμα παράγοντας που συνδέεται με τα επίπεδα των κατεχινών στο τσάι είναι η ώρα και η εποχή συλλογής του. Οι κατεχίνες παράγονται στο φυτό όταν προσλάβει το φώς του ήλιου. Επομένως, όταν συλλέγεται απογευματινές ώρες και κατά την περίοδο του εαρινού ηλιοστασίου, όπου το φώς του ήλιου είναι πιο έντονο και έχει μεγαλύτερη διάρκεια, θα έχει μεγαλύτερα ποσοστά κατεχινών. [Qiang, et al (2009), Yongjun, et al (2020), Wakamatsu, et al (2020), Yong-Quan, et al (2017)]

3.2 ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΚΑΤΕΧΙΝΩΝ

Με την μέθοδο τις χρωματογραφίας εκτός από τις κατεχίνες είναι δυνατή και η ανίχνευση άλλων ουσιών, κυρίως της καφεΐνης, του γαλλικού οξέος και της θεοβρωμίνης. Στα παρακάτω διαγράμματα (διάγραμμα 1, διάγραμμα 2) οι καμπύλες βαθμονόμησης υποδηλώνουν την γραφική παράσταση των κορυφών σε σχέση με την συγκέντρωση. Συγκεκριμένα, ο άξονας των Y απεικονίζει τις περιοχές κορυφών (mAU*sec) που υποδηλώνουν την συγκέντρωση των κατεχινών και ο άξονας X τον χρόνο κατακράτησης των κατεχινών στην ακίνητη φάση. [Huafu, et al (2003), Qiang, et al (2009), Andreas, et al (2019)]

Επίλογος.

Σε αυτό το άρθρο μελετήσαμε την ανίχνευση των κατεχινών στα φύλλα του φυτού Camellia sinensis. Η κύρια μέθοδος για τον προσδιορισμό αυτών είναι η μέθοδος της υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης λόγω του ότι είναι απλή, γρήγορη, ακριβής και ευαίσθητη καθώς επίσης μπορεί να εφαρμοστεί σε όλα τα είδη τσαγιών, εκχυλισμάτων τσαγιού και σε κάποια προϊόντα που περιέχουν τσάι. Ακόμα, μελετήσαμε την περιεκτικότητα των κατεχινών στα διάφορα είδη τσαγιών και είδαμε ότι επηρεάζεται τόσο από την επεξεργασία του τσαγιού όσο και από το κλίμα και την εποχή συλλογής του τσαγιού από το χωράφι. Επιπλέον, τα ποσοστά των κατεχινών επηρεάζονται και από των τρόπο παρασκευής του εκχυλίσματος για την ανάλυση. Κάθε κατεχίνη έχει την δική της ξεχωριστή μοριακή δομή και ιδιότητες και μπορεί να επηρεάζεται από κάποιους παράγοντες λιγότερο και από άλλους περισσότερο σχετικά με τις υπόλοιπες. Οι κατεχίνες διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στο τσάι διότι συμμετέχουν στη διαμόρφωση των περισσοτέρων χαρακτηριστικών του. Το ιδιαίτερο άρωμα και η πολύπλοκη γεύση αυτού καθώς και οι τεράστιες ευεργετικές ιδιότητες του οφείλονται σε μεγάλο βαθμό στη υψηλή περιεκτικότητα του σε κατεχίνες.

5.ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΈΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ

[1] Chenxu, D., Chaoqun, M., Jiao, G., Lei, L., Chun, Z., Lvming, C., Tingyu, W. and Guoqing, C., 2020. Rapid Determination of Catechin Content in Black Tea by Fluorescence Spectroscopy. Journal of Spectroscopy vol. 2020, Article ID 2479612. DOI: https://doi.org/10.1155/2020/2479612

[2] Yongjun, L., Shuai, Z. and Yuanming, S., 2019. Measurement of Catechin and garlic acid in tea wine with HPLC. Saudi Journal of Biological Sciences vol. 27, Issue 11, pp.214-221. DOI: https://doi.org/10.1016/j.sjbs.2019.08.011

[3] L.P., Mathivha, V.S., Thibane and F.N., Mudau, 2019. Anti-diabetic and anti-proliferative activities of DC and Monsonia burkeana Planch. Ex Harv, indigenous to South Africa. Ciara Boardman, Emerald Publishing – UK. British Food Journal, vol. 121, Issue 4, pp. 964-974 DIO: https://doi.org/10.1108/BFJ-10-2018-0697

[4] A., Andreas, D., Muzdalifah, L.Z., Udin, H.H., Kurniawan, O., Zuas, S., Handayani and E., Filaila, 2019. Validated Method for Direct Determination of Catechins by High Performance Liquid Chromatography. American Institute of Physics (AIP) Publishing, vol. 2094, issue 1 United States of America. DOI: https://doi.org/10.1063/1.5097477

[5] Misato, W., Hiroki, Y., Hisashi, S., Tkehiro, I., Rei, K., Ayaka, Y., Yuji, M., Mitsuhiro, S., Kazuhiko, Y. and Katsuko, K., 2019. Catechin and caffeine contents in green tea at different harvest periods and their metabolism in miniature swine. Food Science and Nutrition, vol. 7, Issue 8, pp.2769-2778. DOI: 10.1002/fsn3.1143

[6] M., AlHafez, F., Kheder and M., AlJoubbeh, 2014. Polyphenols, flavonoids and (-)-epigallocatechin gallate in tea leaves and in their infusions under various conditions. Ciara Boardman, Emerald Publishing – UK. Nutrition & Food Science, vol. 44, issue 5, pp.455-463. DOI: http://dx.doi.org/10.1108/NFS-10-2013-0119

[7] Yong-Quan, X., Ying-Na, Z., Jian-Xin, C., Fang, W., Qi-Zhen, D. and JunFeng, Y., 2018. Quantitative Analyses of the Bitterness and Astringency of Catechins from Green Tea. Food Chemistry, vol. 340, pp.16-24. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2018.03.042

[8] Qiang, H., Kai, Y., Dongying, J., Haojun, F., Xuepin, L. and Bi, S. 2009. Determination of total catechins in tea extracts by HPLC and spectrophotometry. Natural Product Research, vol. 23, issue 1, pp.93-100. DOI: http://dx.doi.org/10.1080/14786410801886682

[9] Huafu, W., G. J., Provan and K., Helliwell, 2003. HPLC determination of catechins in tea leaves and tea extracts using relative response factors. Food Chemistry vol. 18, issue 2, pp.307-312. DOI: https://doi.org/10.1016/S0308-8146(02)00510-1

[10] P. L., Fernández, M. J., Martín, A. G., González and F., Pablos, 2000. HPLC determination of catechins and caffeine in tea. Differentiation of green, black and instant teas. Department of Analytical Chemistry, Faculty of Chemistry, University of Seville. Seville, Spain. The Royal Society of Chemistry, The Analyst, pp.421-425. DOI: 10.1039/A909219F

ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΑ ΤΣΟΥΜΑΚΑ